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DNA Marker使用常规知识

1. 保存条件及稳定性

保存在1xLoading dye中的DNAMarker可以室温稳定保存3~6个月。更长时间请于4℃保存。

保存在1xLoading dye中的含Gelred的预染DNA Marker可以室温稳定保存3个月。更长时间请于4℃保存。

含Gelred染料的5xLoading dye（cat No. GR0205）可以短暂保存于室温（<2周），4℃可以稳定保存3~6个月。

2. 电泳缓冲液的选择

实验中常用1xTAE/0.5xTBE缓冲液。

1xTAE缓冲液推荐用于大分子量（>1500bp）DNA和RNA电泳分离。如DL250系列，DL1k系列，DLfast系列，以及DL1004和DL1005推荐优先用1xTAE缓冲液进行电泳。

0.5xTBE推荐用于小于1500bpDNA和RNA电泳分离。如DL050系列，DL100系列DNA Ladder推荐优先用0.5xTBE进行电泳。注意DL1k系列，如果用0.5xTBE缓冲液进行电泳，各DNA条带不能充分进行分离。

3. 凝胶浓度对电泳分离效果影响

总体原则是大片段选择低浓度凝胶，用TAE缓冲液体系电泳，小片段选择高浓度凝胶用TBE缓冲体系电泳。

4. 电泳时核酸染料的选择

GelRed是一种集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的**的荧光核酸凝胶染色试剂。其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染。可以直接紫外灯下观察拍照。使用紫外灯进行观察时，GelRed是EB的完美替代品。

SYBRGreen I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。与GelRed相比，稳定性不好，易降解，并且迁移率受DNA结合染料的量影响较大。

EB(溴化乙锭)是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，方便观察。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配，具有一定的毒性。

DNA Marker使用中常见问题及解决方案

1. DNA条带不可见或很淡，可能原因及解决方法

a)   DNA Marker上样量不够

按照说明书要求加样，或根据自己的实验调整加样量

b)   DNA电泳跑出凝胶

电泳时，将溴酚蓝跑到凝胶2/3处即可停止电泳。更小的DNA片段可能需要电泳的距离更短。

c)   DNA条带被示踪染料遮盖

选用不同的电泳loading dye，使待检测的DNA样品避开示踪染料的干扰，或适当降低loading dye的用量。

d)   凝胶中未加核酸染料或后染时核酸染色不充分。

比如过夜存放的凝胶中EB会分解很多，第二天使用时，DNA条带会明显变弱。因此使用EB作为核酸染料的凝胶，**当天制作并使用。少数剩余的凝胶如果想第二天使用，需要在凝胶表面加入适当缓冲液，并且**用封口膜盖好。

2. 条带弥散或分离不开条带

a)   DNA有部分降解。

b)   电泳时电压过低，使DNA条带发生扩散。

c)   DNA上样量过大，条带变粗，条带间不易分离。

d)   适当减少加样体积可以较明显地改善电泳带型。

e)   使用不合适浓度的琼脂糖凝胶。参照各浓度的琼脂糖凝胶对应的有效分离范围重新制备凝胶。

f)   凝胶质量较差，换用高质量的琼脂糖做胶。

3. 电泳时Marker前端条带容易变弱或丢失。

特指使用EB作为核酸染料时，由于EB与DNA的结合力比较弱，并且EB与DNA的电泳方向相反。当电泳时DNA条带跑到EB的前沿时，EB就会有很大一部分与DNA脱离，DNA条带将变弱。因此，电泳时，将溴酚蓝跑到凝胶2/3处即可停止电泳。GelRed核酸染料由于与DNA的结合非常牢固，不会出现电泳时间长条带变弱的情况。

4. 样品条带与DNA Marker条带相比，出现大小不一致现象

DNA的迁移不仅与实际大小有关，与是否结合有蛋白、离子状态、DNA的结构、凝胶等都有关。

如果使用SYBR Green I，GelRed等核酸染料时，核酸的电泳迁移率与DNA/染料的量的比例关系比较重要，当核酸染料量不足时，就会发生迁移率误差较大的情况。

另外，样品中如果含有较高的盐离子浓度，也会引起较大的迁移误差。

样品上样量与DNA ladder条带的量相差较大或者体积相差较大时，也会引起较大的迁移误差。**是将混好Loading Buffer后的样品体积与DNA Ladder的体积比较接近，这样可以跑出理想的结果。

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